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植物组织培养褐化问题的研究进展


【摘要】 褐化现象在植物组织培养过程中广泛存在,是组织培养成功的主要影响因素。本文从植物组织培养的褐化机理、影响因素以及外植体褐化防止技术措施三方面进行了全面的分析,以期为以后的植物组织培养工作提供理论参考。
  【关键词】 植物 组织培养 褐化
  
  褐化现象是指组织培养诱导脱分化或再分化的过程中,外植体组织从表面向培养基释放褐色物质而使得培养基逐渐变成褐色,外植体随之褐变死亡的现象[1] ,褐化现象又称酚污染,在植物组织培养过程中经常出现。对诱导外植体的脱分化和培再分化过程的影响非常大,甚至是某些植物组织培养成功与否的关键。
  
  1.外植体褐化的机理
  
  引起外植体培物褐化的因素很多,褐化机理也非常复杂,到目前为之,尚未有统一的机理阐述。一般认为,褐化是由于酚类物质被多酚氧化酶(PPO)氧化成醌类物质,抑制了相关酶的活性,从而阻碍培养材料的正常生长,甚至导致培养物死亡[2]。褐化作用按发生机制分为酶促褐化与非酶促褐化。多数研究认为外植体的褐化属于酶促褐化,机理可通过酚-酚酶的区域性分布与组织褐变和酚-酚酶假说两种假说来诠释[3]。
  1.1酚—酚酶的区域性分布与组织褐变假说
  正常的组织细胞内多酚类物质与PPO呈区域性分布,多酚类物质分布在液泡内,PPO则分布在各种质体或细胞质内,两者不能接触。因此,即使底物、PPO、氧气同时存在,正常发育的植物组织并不发生褐变。
  建立外植体时,切口附近的细胞受到伤害,PPO与底物的分隔被打破,酚类物质外溢。细胞受到伤害引起外植体酚类物质外溢属自我保护反应,为防止微生物侵染而诱导植保素或物理屏障的形成。由于酚类物质非常不稳定,在外溢过程中与多酚氧化酶接触,迅速氧化形成褐色的醌类物质和水,醌类物质又在酪氨酸酶等酶的作用下发生脱水、聚合等反应,形成黑褐色物质,从而引起外植体的褐化。
  1.2酚—酚酶假说
  该假说认为褐化过程主要是通过PPO及其底物进行作用的。PPO作为普遍存在于植物体内的一类末端氧化酶,能够催化酚类物质形成醌和水,醌经过非酶促聚合作用形成深色物质并对外植体材料产生毒害作用,使之死亡。褐化过程必须具备酶,底物和氧条件。
  
  2.影响外植体褐化的因素
  
  2.1 外植体本身对褐化的影响
  2.1.1物种及其基因型对褐化的影响。植物组织培养过程中外植体的褐化主要由多酚氧化酶作用于酚类物质而引起的。不同植物品种、同种植物的不同类型因为外植体材料的基因型不同,在组织培养中褐化发生的频率和程度都存在着较大的差异[4]。由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体,木本植物、单宁含量或色素含量高的植物酚类物质含量也很高,木质素、单宁或色素形成多,其组织培养就容易发生褐变。因此,组织培养过程中,木本植物一般比草本植物易发生褐变。目前报道发生褐变的植物中多数是木本植物[5]。在木本植物中,核桃、板栗由于单宁含量很高,进行组织培养难度很大,不仅在接种后的初代培养期容易发生褐变,而且在形成愈伤组织以后也会因为褐变而引起死亡。
  2.1.2外植体生理状态对褐化的影响。褐化程度也因为外植体材料的生理状态不同存在差异。分生组织细胞分裂频率高、生长速度快,所以分生部位外植体比分化部位外植体褐化程度轻。范志强[6]在培养辣椒下胚轴及子叶组织时发现,下胚轴具有较强的分生能力,整个外植体组织生长旺盛,褐变程度比较低。Chever对欧洲栗酚类含量变化的分析结果表明,幼龄材料酚类化合物含量低,而成龄材料含量较高[7],因此培养过程中幼年型材料发生的褐变程度轻于成年型材料。王异星[8]在荔枝无菌苗不同组织的诱导实验中发现,根部极大部分基本不能诱导愈伤组织,即使诱导出愈伤组织也全部褐变;多数叶片较难诱导愈伤组织,诱导出的愈伤组织多出现中度褐变;茎部最容易诱导愈伤组织,且组织生长良好。
  2.2 培养基成分对褐化的影响
  2.2.1无机盐浓度对褐化的影响。初代培养时,培养基中无机盐浓度影响酚类分泌物的产生。邱璐[9]等发现,云桑组织培养过程中使用1/2MS培养基,降低无机盐浓度,能有效减轻褐化发生,降低褐化率。张寒霜[10]等在研究低酚陆地棉胚发生过程中发现,培养基成分中KNO3浓度增加时会引起继代愈伤组织褐化。孔祥生[11]等也发现,与改良MS培养基相比,使用MS培养基,提高柿树组织培养中休眠芽的褐变死亡率9倍,分别降低增殖倍数、有效新梢率67%和55%。
  2.2.2生长调节物质对褐化的影响。细胞分裂素BA或KT不仅能促进酚类物质的合成,且能激活PPO的活性,增强酚类物质的氧化能力,从而加剧褐化的发生。张卫芳[12]等发现,随着培养基中6-BA浓度的升高,组织的褐化率增加,一年生薄壳核桃的茎尖培养中褐化反应时间也随之缩短;添加2,4-D、IAA的组合,褐化反应稍有推迟;较低浓度6-BA适宜茎尖分化生长,褐化反应慢,部分培养基无明显褐化现象。加入BA,KT后甘蔗组织培养[13]褐变更加明显。此外,生长调节物质的浓度也会影响植物组织培养的褐变。在荔枝[8]组织培养的培养基中添加0.5mg/L2,4-D+1mg/LBA,愈伤组织比较坚硬,增殖缓慢,易产生褐变,而培养基中添加1mg/L2,4-D+1mg/LBA后,愈伤组织浅黄疏松,增殖也快。 ......
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